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Los avances recientes han mejorado la producción del antígeno de Lawsonia intracellularis y la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos. Los ensayos de detección por inmunofluorescencia (IF) o inmunoperoxidasa (IPM) son hoy una realidad presente en varios países de todo el mundo que permite la detección rutinaria de anticuerpos específicos contra Lawsonia intracellularis en el suero porcino. Además, en estos momentos se ha desarrollado un ELISA de competición.
Inmunofluorescencia (IF) para la detección de anticuerpos específicos contra Lawsonia intracellularis
Estirpes celulares continuas infectadas con Lawsonia intracellularis fijadas en placas de microvaloración de 96 pocillos o en portaobjetos de ensayo sirven como sustrato del antígeno. Las muestras de suero diluidas 1:30 se incuban con el sustrato para obtener un positivo o un negativo; para valorar el anticuerpo presente pueden utilizarse diluciones seriadas del suero. La unión de los anticuerpos específicos contra Lawsonia intracellularis al antígeno del sustrato se detecta mediante un anticuerpo secundario anti-especie específico marcado con un marcador fluorescente (por ejemplo: anticuerpo de cabra anti-Ig de cerdo conjugado con isotiocianato de fluoresceína, FITC). Como controles se emplean tres sueros positivos (alto, medio y bajo) y un suero negativo. La inmunofluorescencia se evalúa bajo un microscopio con luz UV. Las placas de microvaloración de 96 pocillos se observan en un microscopio invertido.
Los resultados posibles del ensayo son: positivo, negativo o dudoso (figs. 7a y 7b). La tinción inespecífica se considera un resultado negativo. Las reacciones positivas con diluciones ≥ 1:30 se determinan mediante el método de Spearman-Karber. Las diluciones inferiores a 1:30 pueden dar lugar a una tinción inespecífica, que impide realizar una interpretación clara.
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Figura 7a: Inmunofluorescencia inespecífica en un suero negativo de cerdo.
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Figura 7b: Tinción específica de Lawsonia intracellularis en un suero porcino extraído después de la infección. Lawsonia intracellularis puede detectarse en el interior de la célula, en la membrana celular, o en forma libre, sin estar asociado a ninguna célula (3). Aumentos: 160 x.
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Inmunoperoxidasa en monocapa (IPM) para la detección de anticuerpos específicos contra Lawsonia intracellularis
El ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa (IPM) es similar al ensayo de inmunofluorescencia (IF), pero el anticuerpo secundario anti-especie se marca con peroxidasa. El sustrato queda teñido de marrón y puede ser evaluado en el microscopio óptico convencional, prescindiendo de marcadores fluorescentes como en el caso del ensayo de IF, lo cual permite reducir el número de falsos positivos.
ELISA de competición para la detección de anticuerpos específicos contra Lawsonia intracellularis
 Figura 8: Ya existe un ELISA de competición que permite el control semicuantitativo de las poblaciones de cerdos con un elevado rendimiento. |
Disponemos ya de un ELISA de competición que permite realizar un control semicuantitativo de las poblaciones de cerdos con un rendimiento elevado. El ensayo puede automatizarse mediante técnicas robóticas y los datos pueden medirse y evaluarse de forma objetiva, con la consiguiente mejora de la repetibilidad y la comparabilidad (fig. 8).
El antígeno de Lawsonia intracellularis está unido a la placa del ELISA mediante un anticuerpo monoclonal específico. Las muestras de suero, diluidas de acuerdo a las instrucciones del protocolo del ensayo, se incuban con el sustrato del antígeno. Los anticuerpos específicos contra Lawsonia intracellularis presentes en el suero del animal se unen al antígeno. Tras extraer el suero se añade al pocillo un anticuerpo monoclonal secundario marcado con peroxidasa que se une a otro epítopo del antígeno de Lawsonia intracellularis. En presencia de los anticuerpos del cerdo que se han unido previamente al antígeno, este anticuerpo monoclonal secundario dispone de pocos, o nulos, puntos de unión, lo que disminuye, o impide totalmente, su unión al antígeno (inhibición). Tras detener la incubación con el sustrato, la unión del anticuerpo monoclonal conjugado da un color amarillento que puede medirse con un fotómetro. Los pocillos incubados sin suero porcino sirven como referencia del 100% y dos sueros porcinos, uno positivo y otro negativo, se utilizan como controles. La densidad óptica (D.O.) de los pocillos se mide con un fotómetro dotado de filtros de 450 nm.
Los resultados del ensayo se calculan con el valor de referencia del 100% según la fórmula 100 – (D.O. del suero problema / D.O. de la referencia del 100 %) x 100 como porcentaje de inhibición (PI). Los valores de PI se interpretan como positivos, dudosos o negativos según el protocolo del fabricante. Para obtener una información más detallada, los valores PI de cada suero pueden representarse gráficamente y evaluarse con métodos estadísticos como control del proceso o mejora continua del proceso.
Los ensayos serológicos presentan varias ventajas, como son un coste relativamente económico, una ejecución sencilla y una especificidad satisfactoria. Su inconveniente radica en el hecho de que sólo indican la exposición al agente patógeno (Lawsonia intracellularis) y no permiten saber si el cerdo positivo sufre en esos momentos una infección aguda. Además, los ensayos serológicos disponibles en la actualidad no permiten distinguir los anticuerpos generados por la administración de la vacuna de los generados por la exposición natural. Durante el proceso de inmunización, la vacuna también puede estimular la producción de anticuerpos séricos poco detectables, aunque proporcionen una inmunidad protectora.